← Назад
Диагностика и обследования

Молекулярные тесты: ПЦР и NGS

Некоторые изменения при лейкозе настолько малы, что их не покажет ни один микроскоп, — это может быть ошибка в нескольких «буквах» ДНК. Молекулярные тесты работают именно на этом уровне. В этой теме — что такое ПЦР и секвенирование нового поколения (NGS), на какие вопросы они отвечают и что их результаты значат для выбора лечения и контроля ответа на него.

Последнее обновление: Время чтения ~5 мин
Протянувшаяся по тёмно-синему фону полупрозрачная светящаяся спираль ДНК; на одном её участке ступеньки подсвечены тёплым золотым светом, словно их читают.
Рисунок 1.Концепция: молекулярные тесты читают «буквы» ДНК.

01Короткий ответ

Молекулярные тесты напрямую читают ДНК или РНК лейкозных клеток. ПЦР (полимеразная цепная реакция) многократно копирует искомый маленький участок ДНК — до миллиардов копий, поэтому она очень чувствительна и находит даже очень небольшое число лейкозных клеток. Количественная ПЦР измеряет, сколько изменения в образце, — например, при ХМЛ уровень BCR::ABL1 отслеживают на протяжении лечения по международной шкале. NGS (секвенирование нового поколения) одновременно читает десятки и даже сотни генов и помогает выявить при ОМЛ мутации FLT3, NPM1, IDH1, IDH2, TP53, а при ХЛЛ — статус TP53 и IGHV. Эти результаты уточняют диагноз, определяют группу риска и открывают путь к таргетным препаратам. После лечения молекулярные тесты используют для контроля измеримой остаточной болезни (МОБ). Изменения в лейкозных клетках обычно не наследуются, но в редких случаях тест может указать на наследственную предрасположенность — тогда предлагают дополнительный тест и генетическую консультацию.

02Простое объяснение

ДНК — длинная инструкция, записанная четырьмя «буквами». Иногда в лейкозной клетке меняется всего несколько букв, но это может коренным образом изменить поведение клетки. Молекулярные тесты нужны, чтобы находить такие маленькие ошибки.

ПЦР похожа на «молекулярный ксерокс»: она многократно копирует искомый кусочек ДНК, чтобы его можно было увидеть и измерить. Поэтому ПЦР очень чувствительна — она находит единичные лейкозные клетки, спрятавшиеся среди тысяч нормальных.

NGS — это как читать не одну страницу книги, а сразу целую главу: тест одновременно проверяет множество генов. Это особенно важно при таких лейкозах, как ОМЛ, где может быть несколько разных мутаций, направляющих лечение.

Результаты отвечают врачу на три вопроса: какой точно вид лейкоза, каков риск и какие лекарства могут быть особенно полезны. Для некоторых мутаций есть специальные таргетные препараты.

Молекулярные тесты работают и во время лечения: они показывают, насколько глубоко подействовало лечение. Например, при ХМЛ регулярный анализ крови отслеживает, как снижается уровень BCR::ABL1. Всегда обсуждайте результаты с гематологом.

03Научное объяснение

ПЦР и ОТ-ПЦР: по данным NHGRI, ПЦР — быстрый метод «размножения» небольших участков ДНК; за 30–40 циклов образуется более миллиарда точных копий исходного участка. По данным NCI, ОТ-ПЦР сначала превращает РНК в соответствующую ДНК и показывает, активен ли определённый ген; химерные гены (BCR::ABL1, PML::RARA) часто измеряют именно так. ACS отмечает, что ПЦР находит мелкие изменения, невидимые под микроскопом, и хорошо подходит для выявления небольшого числа лейкозных клеток, оставшихся после лечения.

NGS параллельно читает множество участков генов одновременно (NHGRI). По данным ACS, клетки ОМЛ обычно проверяют на изменения в таких генах, как FLT3, IDH1, IDH2, NPM1 и KMT2A, и людям с такими изменениями чаще помогают определённые таргетные препараты. При ХЛЛ мутация TP53 связана с более осторожным прогнозом и влияет на выбор лечения, а мутационный статус IGHV помогает предсказать течение болезни (ACS). При волосатоклеточном лейкозе, по данным NCI, изменение BRAF V600E — определяющий генетический признак, помогающий в диагностике.

Что может быть в заключении? Название гена и изменения (например, «NPM1 тип A» или «FLT3-ITD»), частота вариантного аллеля (VAF — в каком проценте ДНК образца есть изменение) и значимость изменения: патогенное, вероятно патогенное или «вариант неопределённой значимости» (VUS). ELN 2022 относит мутацию NPM1 (без FLT3-ITD) при ОМЛ к благоприятной группе, а мутацию TP53 — к неблагоприятной. VAF иногда может подсказать и то, что мутация может быть наследственной.

Мониторинг и вопросы наследственности: по рекомендациям ELN 2020 года по ХМЛ, BCR::ABL1 измеряют по международной шкале (IS); оптимальным ответом считается ≤10% через 3 месяца, ≤1% через 6 месяцев и ≤0,1% (большой молекулярный ответ) через 12 месяцев. При ОМЛ ELN 2021 рекомендует для МОБ при лейкозе с мутацией NPM1 количественную ПЦР. NCI подчёркивает, что биомаркерный тест опухоли отличается от теста на наследственные мутации, но иногда может выявить изменение, которое может быть наследственным; в этом случае рекомендуют отдельный подтверждающий тест и генетическую консультацию.

04Что происходит в организме?

Образец и сроки

Молекулярные тесты обычно проводят на аспирате костного мозга или крови. Некоторые тесты, дающие срочную информацию (например, FLT3 или PML::RARA), делают как можно быстрее, потому что они могут изменить выбор лечения. Широкие панели NGS могут занять больше времени. Спросите врача, какой результат когда придёт.

ПЦР: увеличить маленький след

ПЦР в каждом цикле удваивает число копий искомого участка ДНК. За несколько часов невидимый след превращается в измеримый сигнал. Количественная ПЦР рассчитывает количество изменения по тому, как быстро появляется этот сигнал, — на этом основан контроль МОБ и ХМЛ.

Маленькие светящиеся фрагменты ДНК на тёмно-синем фоне, число которых слева направо удваивается: один, два, четыре, восемь — справа плотное яркое облако.
Рисунок 2.ПЦР многократно копирует искомый кусочек ДНК.

NGS: читать много генов сразу

При NGS ДНК делят на маленькие фрагменты, миллионы фрагментов читают параллельно, а компьютер снова собирает их вместе. В итоге один тест даёт целый «генетический профиль» лейкоза. Этот профиль может меняться со временем, поэтому при рецидиве тест могут повторить.

Множество тонких светящихся полос ДНК, протянувшихся параллельно на тёмно-синем фоне; на некоторых из них выделяются маленькие фиолетовые точки света.
Рисунок 3.NGS одновременно читает множество генов и даёт генетический профиль лейкоза.

От результата к лечению

Молекулярные находки могут открыть путь к таргетным препаратам: ингибиторам FLT3, IDH1 и IDH2, ингибиторам менина, ингибиторам тирозинкиназ при ХМЛ. Но выбор препарата опирается не на один результат, а на всю картину. Обсудите с гематологом, какие варианты реальны именно для вас.

05Молекулярные тесты шаг за шагом

Четыре шага — от образца до плана лечения.

ДНК/РНК — Выделяют из клеток костного мозга или крови.1ДНК/РНКВыделяют из клеток костного мозга или крови.
ПЦР — Конкретное изменение копируют и измеряют.2ПЦРКонкретное изменение копируют и измеряют.
NGS — Много генов читают одновременно.3NGSМного генов читают одновременно.
Интерпретация — Группа риска и возможности таргетного лечения.4ИнтерпретацияГруппа риска и возможности таргетного лечения.
Генетический профильFLT3, NPM1, IDH, TP53 и др.
Таргетные препаратыВыбор лечения по мутации.
МОБ и мониторингНапример, уровень BCR::ABL1 при ХМЛ.

06Часто проверяемые молекулярные маркеры (упрощённо)

МаркерГде?Почему важен?
BCR::ABL1 (количественная ПЦР)ХМЛ, Ph-положительный ОЛЛДиагноз и контроль ответа на лечение (IS)
PML::RARAОПЛПодтверждение диагноза и МОБ
FLT3 (ITD, TKD)ОМЛИнгибиторы FLT3; оценка риска
NPM1ОМЛГруппа риска; МОБ методом ПЦР
IDH1, IDH2ОМЛИнгибиторы IDH
TP53ОМЛ, ХЛЛНеблагоприятный прогноз; выбор лечения
Мутационный статус IGHVХЛЛПрогноз течения болезни
BRAF V600EВолосатоклеточный лейкозПоддерживает диагноз

* Таблица — упрощённое обобщение; набор тестов зависит от клиники, вида лейкоза и плана лечения. Обсудите значение своих результатов с гематологом.

07Ключевые термины

ПЦР
Полимеразная цепная реакция — тест, многократно копирующий участок ДНК.
ОТ-ПЦР
Вид ПЦР, при котором РНК сначала превращают в ДНК, а затем измеряют.
Количественная ПЦР
ПЦР, измеряющая количество изменения.
NGS
Секвенирование нового поколения — тест, читающий много генов одновременно.
Мутация
Изменение последовательности ДНК.
VAF
Частота вариантного аллеля — в каком проценте ДНК есть изменение.
VUS
Генетический вариант, значение которого пока неизвестно.
Международная шкала (IS)
Стандарт для сравнения результатов BCR::ABL1 при ХМЛ.
Соматическое изменение
Приобретённое в течение жизни изменение только в части клеток; не наследуется.
Генетическая консультация
Беседа со специалистом о наследственном риске и поддержка в решениях.

08Главное

  • Молекулярные тесты находят мелкие изменения в ДНК и РНК.
  • ПЦР очень чувствительна и используется для контроля МОБ.
  • Количественная ПЦР отслеживает уровень BCR::ABL1 при ХМЛ.
  • NGS читает много генов одновременно.
  • Результаты определяют группу риска и таргетные препараты.
  • Некоторые срочные результаты могут изменить выбор лечения.
  • Изменения при лейкозе обычно не наследуются.
  • При подозрении на наследственность предлагают отдельный тест и консультацию.

09Частые вопросы

Чем ПЦР отличается от NGS?

ПЦР очень чувствительно ищет и измеряет конкретное, заранее известное изменение. NGS читает сразу множество генов и может найти и неожиданные мутации. Часто их используют вместе.

В заключении написано «VUS». Стоит ли волноваться?

VUS означает вариант, значение которого пока неизвестно. Обычно решения о лечении на таких вариантах не основывают. Что он значит для вас, спросите у гематолога или генетика.

Передастся ли моя мутация детям?

Большинство мутаций в лейкозных клетках приобретаются в течение жизни и не наследуются. В редких случаях тест указывает на изменение, которое может быть наследственным; тогда врач может предложить отдельный подтверждающий тест и генетическую консультацию.

Почему лечение начинают, не дожидаясь всех результатов?

При остром лейкозе промедление может быть опасным. Врачи иногда начинают лечение, а затем уточняют план по приходящим молекулярным результатам — например, добавляют таргетный препарат.

Как часто проверяют BCR::ABL1 при ХМЛ?

В начале лечения обычно раз в несколько месяцев, затем, по мере стабилизации ответа, реже. Точный график определит гематолог. Важно по возможности сдавать анализ в одной лаборатории, работающей по стандарту IS.

Повторяют ли тест при рецидиве?

Да, часто. Генетический профиль лейкоза может меняться со временем, и новые мутации могут открыть новые возможности лечения. Поэтому при рецидиве молекулярные тесты обычно проводят заново.

10Вопросы врачу

Возьмите эти вопросы на приём. Сохранённые собираются на странице «Мои вопросы» и остаются только на этом устройстве.

  1. Какие изменения нашли тесты ПЦР или NGS?

  2. Какие результаты влияют на выбор лечения?

  3. Будут ли эти тесты использоваться для контроля МОБ?

  4. Если тесты отправляют за границу, сколько ждать результата?

Мои вопросы

12Источники

  1. National Cancer Institute (NCI). NCI Dictionary of Cancer Terms: polymerase chain reaction
  2. National Cancer Institute (NCI). NCI Dictionary of Cancer Terms: next-generation sequencing
  3. National Human Genome Research Institute (NHGRI). Polymerase Chain Reaction (PCR) Fact Sheet
  4. National Human Genome Research Institute (NHGRI). DNA Sequencing Fact Sheet
  5. National Cancer Institute (NCI). Biomarker Testing for Cancer Treatment
  6. National Cancer Institute (NCI). Genetic Testing Fact Sheet
  7. National Cancer Institute (NCI). Adult Acute Myeloid Leukemia Treatment (PDQ®) — Patient Version
  8. National Cancer Institute (NCI). Hairy Cell Leukemia Treatment (PDQ®) — Health Professional Version
  9. American Cancer Society. Tests for Acute Myeloid Leukemia (AML)
  10. American Cancer Society. Tests for CML
  11. American Cancer Society. Tests for CLL
  12. MedlinePlus (U.S. National Library of Medicine). BCR-ABL1 Genetic Test
  13. Blood (American Society of Hematology), 2022. Diagnosis and management of AML in adults: 2022 recommendations from an international expert panel on behalf of the ELN
  14. Blood (American Society of Hematology), 2021. 2021 Update on MRD in acute myeloid leukemia: a consensus document from the European LeukemiaNet MRD Working Party
  15. Leukemia, 2020. European LeukemiaNet 2020 recommendations for treating chronic myeloid leukemia
Медицинское предупреждениеЭта информация предназначена только для ознакомления и не заменяет консультацию врача.
Последнее обновление: ← Вернуться к списку

Открыть интерактивную версию сайта →